Fille de Jean II et d'Isabelle de Portugal, elle entre d'abord en conflit avec son frère, Henri IV, roi de Castille, qui prétend lui substituer comme héritière sa fille, Jeanne la Beltraneja. Mais ce dernier doit s'incliner et accepter le mariage d'Isabelle avec Ferdinand, héritier de la Couronne aragonaise (1469). Après la mort d'Henri IV, elle devient reine de Castille (1474). Son mari Ferdinand, roi d'Aragon en 1479, n'a aucune autorité officielle sur l'État de sa femme. Mais c'est avec son aide qu'Isabelle combat Alphonse V de Portugal, qui, soutenu par Louis XI, envahit la Castille en 1475. Par ses victoires, la reine contraint le roi de Portugal à renoncer à ses prétentions sur la Castille (traités d'Alcáçovas, 1479).
Isabelle s'attache alors à pacifier le pays et à soumettre la noblesse à l'autorité royale. Elle organise l'Administration centrale et les finances de la Couronne et encourage le renouveau culturel de l'Espagne par la création d'universités. Elle joue également un rôle prépondérant dans la réforme du clergé castillan, l'établissement de l'Inquisition (1478), l'expulsion des Juifs de Castille et dans l'achèvement de la Reconquista. En 1492, en effet, les armées d'Isabelle et de Ferdinand s'emparent du royaume de Grenade, dernier bastion de l'Espagne musulmane. La même année, la reine accorde son soutien à l'audacieuse entreprise de Christophe Colomb, qui atteint l'Amérique. En 1496, le pape Alexandre VI donne au couple royal le titre de « Rois Catholiques ».
Tout en sauvegardant jalousement l'autonomie de la Castille, Isabelle n'en a pas moins préparé, par son mariage et son étroite collaboration avec son mari, l'unification politique de l'Espagne dont elle a contribué à bâtir la future puissance coloniale.
