Il collabore avec son oncle Justin dès 518 et lui succède en 527. Très secondé par l'impératrice Théodora, il entreprend de rétablir le territoire de l'ancien Empire romain, de faire de la Méditerranée un lac byzantin et d'extirper l'arianisme. En 532, il conclut avec le souverain perse Khosrô la « paix éternelle » et écrase à Byzance la sédition Nika. Il poursuit la réforme de l'État dans le sens de la centralisation et de l'absolutisme impérial : il fait réviser et classer, dans le Code Justinien, des lois promulguées depuis Hadrien (528-529 et 534) et fait reprendre et codifier la jurisprudence romaine dans le Digeste. Justinien impose également à l'Église l'autorité impériale. Il condamne d'abord le monophysisme (528) et ferme l'université d'Athènes, foyer de paganisme (529). Mais, sous l'influence de Théodora, favorable aux monophysites, il fait déporter le pape Silvère en Asie Mineure.
La reconquête de l'Occident sur les Barbares ariens est menée par ses grands généraux, Bélisaire puis Narsès. En Afrique, les Vandales sont vaincus et leur territoire est réuni à l'Empire romain en 534. La conquête de l'Italie sur les Ostrogoths demande des années de dures campagnes (535-561) ; aux Wisigoths est enlevé le sud-est de l'Espagne (v. 550-554). Mais l'engagement de Byzance en Occident a incité Khosrô à rompre la paix (540) ; les Perses envahissent la Syrie, et Justinien doit leur payer tribut (562). Il doit aussi payer pour le départ des Huns et des Slaves, qui ont plusieurs fois franchi la frontière du Danube.
Centre d'un actif trafic commercial entre l'Europe et l'Asie, Byzance devient aussi un remarquable foyer intellectuel et artistique, ainsi qu'en témoignent la basilique Sainte-Sophie, qu'il fait élever à Constantinople, et la pénétration de l'art byzantin en Occident (Ravenne).
Si Justinien n'a pu reconstituer qu'imparfaitement, et le temps de son règne seulement, l'unité du monde romain, il a su assimiler ce qu'il y avait de plus solide dans l'œuvre de Rome : le droit, grâce auquel il a renforcé l'autorité impériale. C'est aussi de son règne qu'il convient de dater la naissance d'une civilisation proprement byzantine.
